PENETAPAN KADAR PROTEIN

Posted by: Ariein Analisis Protein 

11 Feb 

Pengukuran konsentrasi protein secara akurat menjadi sangat penting peranannya mengingat hasil penetapan ini digunakan dalam perhitungan lain, seperti penentuan aktivitas enzim. Kesalahan dalam penetapan kadar protein akan berbuntut pada kesalahan-kesalahan di perhitungan selanjutnya. Berbagai metode analisis kuantitatif telah ditawarkan dengan kelebihan maupun kelemahan masing-masing. Secara umum, metode analisis kuantitatif protein digolongkan dalam:

• 
  

• Spektrofotometri:
  - Spektrofotometri UV
  - Kolorimetri

• Volumetri:
  - metode Kjeldahl (didasarkan pada analisis Nitrogen)
  - titrasi formol

Kuantifikasi protein secara kolorimetrik pada dasarnya terbagi dalam 2 golongan, yaitu berdasarkan pengikatan dengan zat warna (dye-binding) dan pembentukan kompleks dengan tembaga (copper-chelating).

Metode-metode berdasarkan pengikatan dengan zat warna meliputi:

1. Metode Bradford (Coomassie Blue)
2. Metode Ninhydrin
3. Metode Bromocresol Green
4. Metode Erythrosin-B
5. Metode 3′,3″,5′,5″-tetrabromophenolphtalein ethyl ester (TBPEE)
6. Metode Woodward’s Reagent K

Metode-metode berdasarkan pembentukan kompleks dengan tembaga meliputi:

1. Metode Biuret
2. Metode Lowry (Folin-Ciocalteu)
3. Metode Bicinchoninic Acid (BCA)
4. Metode FeCl3

Standard Protein

Pemilihan standard protein merupakan penentu keberhasilan analisis kuantitatif. Bovine Serum Albumin (BSA) adalah protein yang umum digunakan sebagai standard dalam penetapan kadar protein. BSA banyak dipilih karena tingkat kemurniannya yang tinggi dan harganya relatif murah. Standard protein lain yang bisa digunakan adalah Bovine Gamma Globulin (BCG), terutama untuk keperluan kuantifikasi antibodi karena BCG menghasilkan warna yang sangat mirip dengan immunoglobulin G (IgG). Larutan induk (stok) standard protein biasanya dibuat dalam konsentrasi 1 - 5 mg/mL, namun tidak menutup kemungkinan dibuat larutan stok dengan konsentrasi yang lebih besar. Misalkan larutan stok standard protein yang ingin dibuat adalah 1 mg/mL sebanyak 100 mL, maka ditimbang 100 mg BSA kemudian dilarutkan dalam 100 mL akuades (sebaiknya bebas CO2). Perlu dicatat, ketika larutan stok dibuat, jangan dikocok, karena akan berakibat denaturasi protein (teramati sebagai buih di permukaan larutan). Untuk membantu pelarutan protein, cukup diaduk perlahan. Simpan larutan stok ini (bila belum digunakan) dalam freezer (atau lebih baik pada suhu -20oC).

Preparasi Sampel

Sebelum sampel dianalisis, sampel harus dilarutkan terlebih dahulu, biasanya dalam buffer fosfat (PBS = Phosphate Buffer Saline). Proses pelarutan dilakukan dalam keadaan dingin. Bila sampel berupa padatan, jaringan atau sel, diperlukan langkah pendahuluan sebelum dilarutkan berupa penghancuran (diblender). Bila perlu, lakukan pemurnian protein untuk meminimalkan interferensi matriks. Cara paling sederhana adalah dengan mengendapkan protein menggunakan aseton Prosedur pengendapan protein:

1. Tambahkan aseton 100% (yang telah didinginkan dalam es) pada larutan sampel hingga diperoleh konsentrasi akhir aseton 80% (misal: 2 mL larutan sampel + 8 mL aseton) dalam tabung sentrifuge.
2. Vortex campuran tersebut, kemudian diinkubasi pada -20oC (atau pada freezer) selama 1 jam.
3. Sentrifugasi pada kecepatan 15.000 rpm selama 20 menit pada 4oC.
4. Buang supernatan, endapan dilarutkan kembali dengan PBS dengan vortex dan encerkan secara kuantitatif hingga volume tertentu.